[論文発表]蘚類ヒメツリガネゴケにおけるアスコルビン酸生合成@The Plant Journal誌

2021年7月7日

 蘚類ヒメツリガネゴケにおけるアスコルビン酸生合成の仕組みを明らかにした石川グループの論文がThe Plant Journal誌に受理されました。これは修了生の袖山 翼さん、西川 仁さん、原井健司さんらの研究をとりまとめたものです。

The D-mannose/L-galactose pathway is the dominant ascorbate biosynthetic route in the moss Physicomitrium patens 
Tsubasa Sodeyama, Hitoshi Nishikawa, Kenji Harai, Daiki Takeshima, Yoshihiro Sawa, Takanori Maruta, Takahiro Ishikawa*
The Plant Journal, 107: 1724-1738, 2021 Sep. DOI: https://doi.org/10.1111/tpj.15413
equally contributed/ *corresponding author

 

[研究の概要]

 これまでに、D-マンノース/L-ガラクトース経路(スミルノフ経路)が高等植物のアスコルビン酸生合成の主経路であることがわかっており、緑藻クラミドモナスでも重要な役割を担うことが報告されています。陸上植物の基部にあたる蘚類ヒメツリガネゴケにおいてもスミルノフ経路の構成酵素遺伝子が全て揃っているため、スミルノフ経路は緑色植物においてドミナントな経路であると想定されますが、実験的な裏付けはありませんでした。また興味深いことに、ガラクチュロン酸を介したオルタナティブ経路に関与する「アルドノラクトナーゼ(ALase)の相同遺伝子」がヒメツリガネゴケに存在することから、コケ植物ではスミルノフ経路とガラクチュロン酸経路の両方が機能する可能性も示唆されました。そこで、生理生化学や分子遺伝学的手法を用いて解析した結果、1)ヒメツリガネゴケではスミルノフ経路がアスコルビン酸生合成に関与すること、2)ALaseは実際にALase活性を有しているものの、アスコルビン酸生合成には関与しないこと、3)この酵素は酸化型アスコルビン酸(デヒドロアスコルビン酸)の分解酵素として機能する可能性が示されました。

 

[研究の詳細]

1. 背景

 アスコルビン酸は優れた抗酸化剤であり、植物の主要レドックスバッファーです。高等植物において、アスコルビン酸はヘキソースリン酸プールからGDP-D-マンノースやL-ガラクトースを介して合成されます(図1左;スミルノフ経路)。これまでに単離されたシロイヌナズナのアスコルビン酸欠乏変異株(vtc1vtc4)の原因遺伝子のうち、VTC3以外の遺伝子はスミルノフ経路構成酵素をコードすることから、この経路が高等植物においてアスコルビン酸生合成の主経路であることは遺伝学的にも立証されています。VTC3タンパク質はキナーゼおよびホスファターゼの両ドメインを持つ変わったタンパク質で、スミルノフ経路の調節に関与すると考えられていますが、その詳細は不明です。また、この経路は緑藻クラミドモナスにおいてもアスコルビン酸生合成に必須であることから、緑藻から高等植物にいたる緑色植物において普遍的な経路であると推察されます。実際に、コケ植物、例えば蘚類ヒメツリガネゴケにおいてもスミルノフ経路の構成酵素遺伝子が全て保存されています。しかし、コケ植物における同経路の研究例は今までありませんでした。

 一方、微細藻類ユーグレナはガラクチュロン酸を中間体とした経路(ガラクチュロン酸経路)でアスコルビン酸を合成します。この経路においてL-ガラクトン酸からL-ガラクトノ-1,4-ラクトンへの変換(最終段階の一歩手前)を触媒するのがアルドノラクトナーゼ(ALase)で、この酵素は既にユーグレナで同定済みでした。ガラクチュロン酸経路は高等植物でも機能的である可能性が提唱されています。例えば、果実の成熟に伴うペクチンの分解によって大量のガラクチュロン酸を生成できるため、このような条件ではスミルノフ経路の代替経路として機能するかもしれません。しかし、高等植物にはALaseの相同遺伝子が存在しないため、その詳細は不明でした。興味深いことに、ヒメツリガネゴケにはALaseの相同遺伝子が二つ存在(PpALase1および2)しており、コケ植物ではスミルノフ経路とガラクチュロン酸経路の両方が機能的である可能性が示唆されました。そこで本研究では、ヒメツリガネゴケを実験材料として用いて、ALaseに加えて、スミルノフ経路の鍵酵素であるGDP-L-ガラクトースホスホリラーゼ(GGP/VTC2)およびVTC3の機能解析を試みました。

 

2. ヒメツリガネゴケにおけるアルドノラクトナーゼの存在

 上述の通り、ヒメツリガネゴケには二つのALase相同遺伝子(PpALase1および2)が存在することがわかりました。PpALase1と2の同一性は16.7%と低いものの、類似性は50%程度で、両ALaseのアミノ酸配列はユーグレナALaseやヒトのオーソログ(SMP30)と30%前後の同一性を示しました。大腸菌を用いて両酵素のリコンビナント酵素を作製・精製し、酵素学的性質を調べたところ、PpALase1のガラクチュロン酸に対するKm値およびKcat値はそれぞれ2.98 mMおよび188.3 s-1でした。PpALase2も同程度のKm値を示したのですが、一方でKcat値は4.87 s-1と低く、その触媒効率(Kcat/Km)はPpALase1の40倍以上低いことがわかりました。同様の結果は、L-ガラクトノ-1,4-ラクトンを基質として用いた実験からも得られました。これらの結果から、PpALase1および2はALaseとしての酵素活性を有していこと、特にPpALase1が主要酵素であることが強く示唆されました。

 

3. ヒメツリガネゴケはスミルノフ経路を使ってアスコルビン酸を合成する

 次に、ALase1、VTC2およびVTC3の遺伝子破壊株を作出しました。ヒメツリガネゴケは三つのVTC2相同遺伝子(VTC2-1VTC2-3)を持っていましたが、これらの遺伝子の光応答性解析の結果、VTC2-3はほとんど光応答性を示さず、発現量も極めて低かったため、VTC2-1およびVTC2-2に焦点を絞りました。なお、ヒメツリガネゴケにVTC3遺伝子は一つだけ存在しました。

 野生株と比較して、VTC2-1およびVTC2-2破壊株の両方において著しいアスコルビン酸レベルの低下(それぞれ野生株の46%および17%)が認められました(図2)。この結果から、スミルノフ経路はヒメツリガネゴケにおいて機能的であることが初めて明らかになり、特にVTC2-2が重要であることがわかりました。また興味深いことに、VTC3欠損株でもアスコルビン酸レベルの低下が生じました。

 また、VTC3欠損株では、暗順応後の光照射によるアスコルビン酸レベルの増加が顕著に抑制されました(図3)。同じ結果はシロイヌナズナのvtc3変異株でも報告されており、VTC3はコケ植物においてもアスコルビン酸生合成の光調節に関与することが明らかになりました。

 さらに、これらの欠損株では原系体の側枝の生育が抑えられ、この表現型は外部からのアスコルビン酸処理によって回復しました(図4)。したがって、スミルノフ経路を介したアスコルビン酸合成はヒメツリガネゴケの十分な成長に不可欠であることがわかりました。

 一方、ALase1破壊株ではアスコルビン酸レベルの低下は起こらず、むしろ野生株と比較して有意に増加することがわかりました(図2)。この結果は、ALase1がアスコルビン酸生合成に関与しないことを意味しているのですが、興味深いことに、破壊株におけるアスコルビン酸の増加は還元型ではなく、酸化型(デヒドロアスコルビン酸、DHA)の増加に起因していました(図2右上)。このことから、ALase1はDHAの濃度調節に関与する可能性が示唆されました。さらに興味深いことに、2週齢までの時点において、ALase1破壊株は野生株と同様の表現型を示したのですが、3週齢以降に急速に茶褐色化し、細胞死が促進されたような表現型を示しました。このように、ALase1破壊株ではアスコルビン酸が増加しているにも関わらず、顕著な表現型を示すことがわかりました。

 

4. アルドノラクトナーゼはデヒドロアスコルビン酸の分解酵素?

 なぜ、ALase1破壊株ではDHA量が増えるのでしょうか。過去にラット由来のラクトナーゼがDHAの分解反応を触媒することが報告されており、ALase1もDHA分解酵素として機能する可能性を考えました。実際に、DHAに対する活性を調べたところ、VmaxおよびKm値はそれぞれ15.4 μmol min-1 mg-1 proteinおよび3.75 mMでした。ヒメツリガネゴケは高等植物の葉と同レベルのアスコルビン酸を含んでいます。そのうち、約一割程度が酸化型として存在すると考えると、ヒメツリガネゴケにはmMオーダーのDHAが含まれると想定されるため、この酵素はDHA分解酵素として十分に機能的であると考えられます。すなわち、ALase1欠損株ではDHA分解反応が滞った結果としてDHAが蓄積したことが示唆されました。また、ALase1欠損株ではアスコルビン酸再生酵素活性が増加しており、これも増加したDHAに対する応答であると考えられました。

 

5. まとめと考察

 以上の結果より、高等植物や緑藻と同様に、ヒメツリガネゴケもスミルノフ経路を使ってアスコルビン酸を生合成することが明らかになりました。このように、スミルノフ経路は緑色植物で高度に保存された主たるアスコルビン酸経路であることがわかりました。紅藻もスミルノフ経路を利用すると考えられているのですが、面白いことにVTC2遺伝子を持っていません(他のスミルノフ経路の構成酵素遺伝子は全て揃っている)。そのため、VTC2と機能的に相同な別遺伝子が存在すると考えられていますが未解明です。スミルノフ経路は単細胞の緑藻で現在の形として確立された後、陸上植物でも主経路として高度に保存されてきたのでしょう。

 さらに、高等植物においてスミルノフ経路の光制御に関与すると考えられているVTC3もまた、ヒメツリガネゴケで機能的であることが今回の研究でわかりました。VTC3は緑藻や紅藻にも存在するのですが(その機能は未解明)、緑藻の場合、スミルノフ経路は光よりも、むしろ活性酸素によって調節されているようですので、VTC3の機能は緑藻と陸上植物で多少異なる可能性があります。このあたりの調節因子の進化も今後の興味深い課題です。今、石川グループでは他のコケ植物にも興味を持って研究を進めていて、ヒメツリガネゴケと比較したときに、かなり興味深い特徴を持つことがわかってきました。とても面白い研究に発展しそうです。

 一方で、ALase遺伝子の存在によって、ようやくガラクチュロン酸経路が植物でも機能的であることを証明できるかも!!と期待されたのですが、残念ながら(?)、少なくともヒメツリガネゴケにおいてALaseはアスコルビン酸生合成に関与しないようです。それよりも、酸化型アスコルビン酸(DHA)の分解酵素として重要な役割を担う可能性が出てきました。DHAから還元型への再生にはグルタチオン依存の仕組みが重要なのですが、ヒメツリガネゴケのグルタチオン含量は低いため、アスコルビン酸再生能力も低いと思われます。DHAはタンパク質システインの酸化剤としても機能するため、潜在的に毒性です。したがって、再生能力の低さ故に、ALaseを使って分解能力を上げることで、DHAの毒性を回避しているのかもしれません。逆に、高等植物は高いアスコルビン酸再生能力を持っているので、DHA分解酵素としてのALaseが不必要なのかもしれませんね(実際に遺伝子が見つからない)。これらのストーリーが本当だったとしたら、ヒメツリガネゴケではアスコルビン酸のターンオーバーが速いはずです。それにも関わらず、高等植物と同レベルのアスコルビン酸を蓄積できるのはなぜなのか?そこまでしてアスコルビン酸を高蓄積する理由はなんなのか?まだまだ、興味深い謎が残されています。

 

 


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